【医药卫生杂志】关于医药卫生的论文：谈北豆根提取物中有效成分分析方法的建立

北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum ＤＣ．的干燥根茎，其有效部位是生物碱。现已知北豆根中含有近２０ 种生物碱，总碱含量可达１％以上，其中含量最高的生物碱为蝙蝠葛碱，其含量约占总生物碱的５０％左右［１］ 。北豆根总碱（ＴＡＭＤ）对呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其对肺炎球菌效果更为显著。其制剂北豆根片可治疗急性咽炎、扁桃体炎，经过多年的临床应用已收入２００５ 版《中国药典》。２００５ 版《中国药典》用酸碱滴定法控制含量，终点不易判断，误差大。本实验采用酸性染料比色法测定提取物中ＴＡＭＤ 的含量，采用高效液相色谱法测定提取物中蝙蝠葛碱的含量，从而用这两个指标控制提取物的质量。
　　１  　器材
   
　　ＨＰ －８４５３ 紫外－可见分光光度计；ＡＧ －２５４ 型电子分析天平（瑞士梅特勒）；ＷＴ －０２ 型电热恒温干燥箱（北京恒星医疗器械厂）；ＺＦＱ －８５Ａ 型旋转蒸发仪（上海医械专机厂）；Ｒ２００２ 型旋转蒸发仪（上海申顺科技公司）；ＪＡＳＣＯ 高效液相色谱仪（ＵＶ －１５ 紫外－可见检测器，ＲＵ －１５８０ 泵，ＣＫＣｈｏｍ 色谱工作站，日本）；北豆根饮片（市售，承德产，经鉴定为蝙蝠葛）；北豆根碱（对照品，自制，含量９９．０％）；９５％乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、无水甲醇、磷酸、酚酞为分析纯； 甲醇、乙腈为色谱纯。
　　２  方法与结果
　　２．１  酸性染料比色法测定提取物中ＴＡＭＤ 的含量［２］
　　２．１．１  比色原理不吸收可见光的无色物质通过络合、氧化还原等反应生成有色物质，可用于比色测定。实验证明，溴甲酚绿在无水甲醇（ｐＨ ＝６）中，可与ＴＡＭＤ 直接络合生成绿色化合物，用于比色测定。
　　２．１．２  最大吸收波长的选择精密称取蝙蝠葛碱对照品（６０℃干燥至恒重）１０．０ ｍｇ 置５０ ｍｌ 容量瓶中，加无水甲醇溶解，最后用无水甲醇定容至５０ ｍｌ，作为对照品溶液。
   
　　精密吸取对照品溶液１．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ ｍｌ，用无水甲醇定容，在２００ ～７００ ｎｍ 进行扫描，选择最大吸收波长，确定最大吸收波长为６２０ ｎｍ。
　　２．１．３  显色剂用量的考察分别精密吸取０．１％溴甲酚绿溶液０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，再分别加入对照品溶液１．０ ｍｌ，用无水甲醇定容，在６２０ ｎｍ 处测定吸收度。结果见表１。
　　表1  蝙蝠葛碱与溴酚绿络合后的吸收度（略）
　　结果表明，显色剂用量为０．２ ｍｌ 时吸收度最大，故选用显色剂用量为０．２ ｍｌ。
　　２．１．４  显色稳定性的考察以加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ ｍｌ的样品为考察对象，在１２０ ｍｉｎ 内于６２０ ｎｍ 处测定吸收度，随行试剂空白。结果见表２。
　　表2  蝙蝠葛碱的显色稳定性考察（略）
　　平均吸收度为０．４２３，RSD为０．０３％，表明吸收度在１２０ ｍｉｎ内没有明显变化。
　　２．１．５  标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液０．３，０．５，０．８，１．０，１．２，１．５，２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ ｍｌ，于６２０ ｎｍ 测定吸收度，随行试剂空白。以蝙蝠葛碱浓度C 对吸收度A 进行线性回归，得标准曲线方程：C ＝４９．９１A －０．８８，r ＝０．９９９ ８ （n ＝７），线性范围为６ ～４０ μｇ· ｍｌ－１ 。
　　２．１．６  精密度实验取２．１．５ 中的样品（２０ μｇ· ｍｌ－１ ）测定吸收度，重复测定５ 次，平均吸收度为０．４２３，RSD 为０．１１％。
　　２．１．７  加样回收率实验精密称取北豆根提取物２．０ ｍｇ（总碱含量以北豆根碱计为９２．７％），置１０ ｍｌ 容量瓶中，加无水甲醇使溶解，超声提取１５ ｍｉｎ，用无水甲醇定容至１０ ｍｌ，总碱浓度以蝙蝠葛碱计０．１８５ ｍｇ· ｍｌ－１ 。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为０．２ ｍｇ· ｍｌ－１ 。分别精密吸取两种溶液各０．４，０．５，０．６，０．８，１．０ ｍｌ，一一对应混合于１０ ｍｌ 容量瓶中，无水甲醇定容。测定结果见表３。
　　表3  TAMD的回收率（略）
　　２．２  高效液相色谱法测定提取［文章来源于 www.99ZuoWen.Com］物中蝙蝠葛碱含量［３］
　　２．２．１  色谱条件色谱柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ －Ｃ１８ （５ μｍ，４．６ ｍｍ ×２５０ ｍｍ）；流动相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５（V∶V∶V）；流速：０．５ ｍｌ· ｍｉｎ－１；波长２０８ ｎｍ；柱温：室温；进样量２０ μｌ；理论塔板数２ ３００。
　２．２．２  北豆根对照品、提取物和药材的ＨＰＬＣ 的图谱见图１。
　　图1  北豆根对照品提取物和药材的HPLC图谱（略）
　　２．２．３  标准曲线的绘制精密称取蝙蝠葛碱对照品（６０℃干燥至恒重）５．０ ｍｇ 置２５ ｍｌ 容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品溶液。分别精密吸取对照溶液０．５，１．０，１．５，２．０，３．０，４．０，５．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，按上述条件进行检测，以峰面积（Y）对浓度（X）进行直线回归，得回归方程为：Y ＝１．５３ ×１０８ X ＋１．１８ ×１０４ ；r ＝０．９９９ ８ （n ＝７） ， 线性范围为０．０１ ～０．１ ｍｇ· ｍｌ－１ 。
　　２．２．４  精密度实验选用“２．２．３”项浓度为０．０４ ｍｇ· ｍｏｌ－１ 的样品，连续进样５ 次，计算峰面积，平均峰面积为６０５８０３０，RSD 为０．１５％。
　　２．２．５  加样回收率实验精密称取１０．０ ｍｇ 北豆根提取物（蝙蝠葛碱含量为４８．０６％）置５０ ｍｌ 容量瓶中，加入流动相溶解，超声提取１５ ｍｉｎ，用流动相定容，浓度为０．０８９ ２ ｍｇ· ｍｌ－１ 。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为０．２ ｍｇ· ｍｌ－１ 。精密吸取样品溶液１．０，２．０，３．０，４．０，５．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，分别加入对照品溶液０．４，０．８，１．２，１．６，２．０ ｍｌ，用流动相定容后测定含量。结果见表４。
　　表4  蝙蝠葛碱的回收率（略）
　　２．３  　含量测定
　　２．３．１  北豆根药材的处理［４］ 饮片粉碎过４０ 目筛，６０℃干燥。称取１．０ ｇ 置索氏提取器中，加入氯仿３０ ｍｌ，氨水１．０ ｍｌ，浸泡２４ ｈ。再加入氯仿５０ ｍｌ，８０℃水浴回流３ ｈ，水浴蒸干氯仿。残渣用无水甲醇溶解，溶液转移置５０ ｍｌ 容量瓶中，无水甲醇定容，作为备试溶液。
　　２．３．２  北豆根提取物的处理精密称取北豆根提取物（６０℃干燥至恒重）２．０ ｍｇ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，加无水甲醇溶解，过滤，洗涤容器及滤器３ 次，合并滤液及洗液，用无水甲醇定容至１０ ｍｌ备用。
　　２．３．３  　北豆根药材中ＴＡＭＤ 的测定取备试溶液１．０ ｍｌ 置１０ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ ｍｌ，用无水甲醇定容，于６２０ ｎｍ 测定吸收度，随行试剂空白。根据回归方程计算ＴＡＭＤ 含量。经测定，本实验所选用的北豆根药材中ＴＡＭＤ 含量为１．２３％。
　　２．３．４  北豆根药材中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液３．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，挥干甲醇，加入流动相适量，振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定，本实验所选用的北豆根药材中蝙蝠葛碱的含量占ＴＡＭＤ 的４５．７６％。
　　２．３．５  北豆根提取物中ＴＡＭＤ 的测定取备试溶液０．５ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ ｍｌ ，用无水甲醇定容，于６２０ ｎｍ 测定吸收度，随行试剂空白。根据回归方程计算ＴＡＭＤ 含量。经测定，本实验所得到的北豆根提取物中ＴＡＭＤ 含量为９２．７１％。
　　２．３．６  北豆根提取物中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液２．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中（浓度为４％），挥干甲醇，加入流动相适量，振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定，本实验所得到的北豆根提取物中蝙蝠葛碱的含量占ＴＡＭＤ 的４８．０６％。
　　3  讨论
   
　　中药质量标准的研究一直是中药现代化研究中的重要组成部分。由于中药成分复杂或有效成分不明确，有些直接以原药材或粗提物入药，使得很多中药的含量测定成为难点。近年来，一些现代化技术的应用推动了中药有效成分的提取、分离和含量测定的研究。《中国药典》２００５ 版收录的北豆根片中只规定了ＴＡＭＤ 的含量测定，方法为酸碱滴定法。由于各地北豆根药材中，ＴＡＭＤ 的组成有差别［４］ ，只控制ＴＡＭＤ 的含量尚不能全面反映制剂所需的原料和成品的质量。本实验测定了单体蝙蝠葛碱在总碱中的含量，进一步完善了提取物和制剂的质量标准。酸碱滴定法操作复杂，终点不易判定，误差大。本实验采用酸性染料比色法测定ＴＡＭＤ 含量、采用高效液相色谱法测定蝙蝠葛碱含量，操作简单，方法专属性强，灵敏度高。
【参考文献】
  　　［1］ 徐国钧，徐珞珊，何宏贤，等．中国药材学［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，１９９６：１．

　　［2］ 张 怡，王爱华．北豆根气雾剂质量标准研究［Ｊ］．中草药，２００２，３３（１１）∶９９９．

　　［3］ 李 辉，陈 辉，陈发奎．ＨＰＬＣ 测定北豆根胶囊中山豆根碱含量［Ｊ］．中成药，２００１，２３（１１）∶８３９．

　　［4］ 方立琼，郭济贤，郑立行．蝙蝠葛中药北豆根与山豆根质量评价［Ｊ］．上海医科大学学报，１９９２，１９（２）∶１２４．

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